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CurieCoreTech
Présentation
L'Institut Curie est un leader mondial dans le domaine des technologies single cell et spatiales appliquées à la biologie (du cancer) et à l'immunologie.
L'Initiative Single Cell de l'Institut Curie propose:
- Une équipe d'experts en Single Cell et Spatial Omics à votre service
- Un large portefeuille de technologies de pointe
- Un pipeline intégré de la conception de l'étude à l'interprétation des données
Pour un aperçu rapide de notre portefeuille, téléchargez notre brochure.
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L’hétérogénéité des cellules saines, tumorales et immunitaires joue un rôle clé dans le développement normal et pathologique, ainsi que dans la réponse aux traitements. Les analyses conventionnelles (en bulk) étudient une population globale de cellules et ne permettent pas de détecter des sous-populations de cellules rares. Afin de pouvoir distinguer l’identité de chaque cellule individuellement, des technologies haut débit à l’échelle de la cellule unique, dites « single cell », sont en plein développement. Elles permettent d’adresser des questions jusque-là restées sans réponse en étudiant le génome, l'épigénome, le transcriptome, le protéome et le métabolome avec une résolution à cellule unique.
Au centre de recherche de l’Institut Curie, quatre plateformes technologiques du réseau CurieCoreTech (Plateforme de Séquençage ADN Haut Débit (NGS ICGEX), plateforme Custom Single Cell Omics, Cytométrie et Bioinformatique) ont décidé d’unir leurs forces et de créer l’Initiative Single Cell. Ce programme structurant vise à coordonner et à partager les ressources pour optimiser les services et les développements des technologies Single Cell pour la communauté scientifique.
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Publications clés
Science Immunology - 08/01/2021
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Nature Communications - 01/12/2020
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Cell - 01/10/2020
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Cancer Discovery - 01/09/2020
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Cell Reports - 01/02/2020
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Nature Genetics - 01/06/2019
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Choix de la technologie
L'Initiative Single Cell met à votre disposition une brochure offrant une vue d’ensemble de l’offre « single cell et spatial» à l’Institut Curie, ainsi qu’un arbre de décision pour vous aider à sélectionner la technologie qui répondra à vos besoins et à identifier la/les plateforme(s) à contacter.
Brochure offre single cell et spatial à l'Institut Curie
Flyer Single Cell Initiative Institut Curie
Arbre de décision pour l'offre single cell et spatial à l'Institut Curie
Matériel de départ
Selon la technologie appliquée, les analyses à cellule unique ("single cell") peuvent nécessiter un matériel biologique différent. En dehors des approches spatiales, qui peuvent être appliquées sur des tissus frais congelés ou fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), la plupart des technologies single cell nécessitent des cellules ou des noyaux dissociés et isolées. Celles-ci peuvent être obtenus à partir de cellules cultivées, de sang ou de tissus.
Une bonne qualité de suspension cellulaire est la clé d'une expérience single cell réussie. Les suspensions cellulaires sont généralement obtenues par digestion enzymatique et/ou dissociation mécanique. Prenez le temps d'optimiser votre protocole pour réduire le temps de manipulation des suspensions cellulaires et donc les débris, les agrégats et/ou la mort cellulaire.
Isolation de cellules uniques
Une fois qu'une bonne suspension cellulaire a été obtenue, les cellules/noyaux individuels doivent être isolés. Pour cela, plusieurs options existent :
10X Chromium
Disponible sur la plate-forme NGS, ainsi que sur les plateformes Cytométrie d'Orsay et de St Cloud/Suresnes, le 10X Chromium X utilise une microfluidique avancée pour effectuer le partitionnement individuel des cellules permettant un indexage spécifique de chaque cellule. Il fait partie intégrante de toutes les applications monocellulaires 10X Genomics.
Cytométrie en flux
Disponible sur la plateforme Cytométrie, les trieurs permettent d'isoler vos cellules en fonction de la présence de certains marqueurs (par exemple jusqu'à 50 récepteurs à la surface cellulaire) et ainsi de trier exclusivement les cellules d'intérêt dans l'expérience single cell.
CellenONE
Disponible sur la plate-forme Custom Single Cell Omics, CellenONE est un dispositif de tri de cellules individuelles basé sur l'image, idéal pour les faibles quantités de cellules. Le rendement est très élevé (peu de cellules perdues) et les volumes morts sont faibles.
Technologies Single Cell
Single Cell Génomique
Le séquençage de l'ARN et d'ADN à cellule unique (« single cell ») permet d'étudier le transcriptome et le génome de cellules individuelles. Différentes méthodes complémentaires existent. La méthode utilisée dépendra de votre question biologique et de votre matériel de départ:
Séquençage d'ARN 3’
Le séquençage d’ARN 3’ permet de quantifier l’expression des gènes et d’identifier des populations cellulaires. Dans le séquençage ARN 3', les ARN messagers poly(A)+ sont reverse transcrits à l'aide d'une amorce polydT. Cette séquence polydT est juxtaposée aux codes-barres nécessaires à l’identification des cellules uniques et au séquençage. Les molécules d'ADNc générées sont amplifiées puis fractionnées. Seules les extrémités 3' des transcrits portant les codes-barres sont représentées dans les banques et seront séquencées. Le 3' scRNA-seq représente une méthode relativement simple de quantification des ARNm poly(A)+ de cellules individuelles.
3' scRNA-seq sur la plateforme NGS
3' scRNA-seq est disponible en routine sur la plate-forme NGS en utilisant le pipeline 10X Genomics. Le matériel d'entrée requis est de 1 000 à 20 000 cellules ou noyaux et le taux de récupération (rendement) est d'environ 50 % des cellules/noyaux chargés. Les recommandations de séquençage sont d'environ 50 000 à 100 000 reads par cellule ou noyau.
Le 3' scRNA-seq peut être combiné à des anticorps spécifiques afin de mesurer l’expression de protéines de la surface cellulaire (CITEseq) ou bien pour augmenter la capacité de multiplexage (Cell Hashing). Les effets de perturbations du transcriptome par CRISPR peuvent également être évalués à la résolution de cellules uniques en combinant la capture directe des sgRNA avec la mesure de l’expression des gènes au sein de chaque cellule.
Séquençage single cell d'ARN complets
Contrairement au séquençage d'ARNc 3' ou 5', le séquençage d'ARN complets couvre l'intégralité de la séquence des molécules d'ARN, permettant par exemple la résolution des allèles, ainsi que l'identification des isoformes d'épissage et des variantes génétiques.
Séquençage single cell d'ARN pleine longueur sur la plateforme Custom Single Cell Omics
Deux technologies de séquençage single cell d'ARN entiers, Smart-seq3 et plus récemment FLASH-seq, sont disponibles sur la plateforme Custom Single Cell Omics. Ces technologies quantifient des milliers de molécules d'ARN par cellule, affichant une sensibilité nettement supérieure par rapport au Smart-seq2 précédent. Le choix entre Smart-seq3 et FLASH-seq se fera en fonction du projet et en discussion avec la plateforme. L'avantage du FLASH-seq est la possibilité de le combiner avec de l'ATAC-seq ou du scCNV dans les mêmes cellules, obtenant ainsi des données multi-omiques single cell.
Le matériel de départ doit compter au moins une centaine de cellules par échantillon.
Séquençage single cell d'ARN pleine longueur sur la plateforme NGS
Le développement d’une approche combinant les techniques de transcriptomique en cellule unique 10X Genomics et de séquençage Long Read, par PacBio ou Oxford Nanopore Technologies, est en cours à la plateforme NGS. Cette approche unique disponible à la plateforme NGS génère des reads couvrant la totalité des transcrits (de l’extrémité 5’ à 3’) permettant ainsi d’étudier les isoformes de manière précise, sans besoin d’assemblage.
5' scRNA-seq+ VDJ
Le séquençage d’ARN 5’ permet de quantifier l’expression des gènes et d’analyser le répertoire immune. Dans le séquençage d'ARN 5', les ARNm poly (A) + sont reverse transcrits à l'aide d'une amorce polydT. Cependant, et contrairement au séquençage d'ARNc 3', les codes-barres de séquençage ne sont pas adjacents à l'amorce polydT, mais ils sont situés à l'extrémité 5' des transcrits. L'avantage et l'utilisation majeur du 5′ est de combiner le profilage de l'expression génique avec l'identification de la totalité des fragment V(D)J (chaînes a et b du TCR, chaîne lourde et légère des Igs et BCR dans les cellules B) dans les mêmes cellules.
5' scRNA-seq sur la plateforme NGS
Le 5' scRNA-seq est disponible en routine sur la plate-forme NGS en utilisant le pipeline 10X Genomics. Le matériel d'entrée requis est de 1 000 à 20 000 cellules ou noyaux et le taux de récupération (rendement) est d'environ 50 % des cellules/noyaux chargés. Les recommandations de séquençage sont d'environ 50 000 à 100 000 reads par cellule ou noyau.
Le 5' scRNA-seq peut être combiné avec des anticorps spécifiques afin de mesurer l’expression de protéines de la surface cellulaire à l'aide (CITEseq) ou bien pour augmenter la capacité de multiplexage (Cell Hashing).
Séquençage single cell d'ADN (scCNV)
Le séquençage d'ADN en single cell permet d'identifier les nombres de copies de l'ADN (single cell Copy Number Variation). Dans ce protocole, les noyaux sont soumis à une dégradation des protéines, suivie d'un marquage par Tn5 et d'une amplification PCR, sans aucune étape de purification. L'ADN ainsi obtenu est ensuite séquencé. Le protocole peut être combiné ou non au séquençage des ARN cytoplasmiques de la même cellule, par FLASH-seq. Les nombres de copies peuvent ainsi être comparé au niveau d'expression des gènes.
Séquençage single cell d'ADN sur la plateforme Custom Single Cell Omics
Le séquençage single cell single cell d'ADN, combiné ou non au séquençage des ARN, est en cours de validation sur la plateforme Custom Single Cell Omics et sera proposé en service courant 2025.
Single cell Épigénomique
L'épigénomique à cellules unique (« single cell ») est l'étude de l'épigénome au niveau de la cellule individuelle. Il permet par exemple d'étudier la compaction de la chromatine et les marques d'histone dans chaque cellule et d'établir un lien avec les niveaux d'expression des gènes. L'hétérogénéité épigénétique au sein d'une population de cellules peut ainsi être évaluée, et des événements épigénétiques rares peuvent être identifiés. L'initiative Single Cell propose plusieurs approches :
scATAC-seq
Single Cell ATAC-seq, dans lequel ATAC signifie « Assay for Transposase Accessible Chromatin », permet de mesurer l'accessibilité de la chromatine au niveau de la cellule unique. Le test repose sur la transposase Tn5, qui coupe les régions de chromatine accessibles et charge les adaptateurs NGS sur les fragments d'ADN pour le séquençage. L’ATAC-seq à cellule unique fournit des informations sur les types et les états cellulaires, ainsi que sur les mécanismes de régulation des gènes.
scATAC-seq sur la plateforme NGS
ATAC-seq à cellule unique est disponible sur la plate-forme NGS en utilisant le pipeline 10X Genomics. Le matériel d'entrée requis est de 1 000 à 20 000 noyaux et le taux de récupération (rendement) est d'environ 50 % des noyaux chargés. Les recommandations de séquençage sont d'environ 25 000 reads par noyau.
Image : 10X Genomics
scATAC-seq sur la plateforme Custom Single Cell Omics
Une approche de scATAC-seq en plaque est en cours de validation sur la plateforme Custom Single Cell Omics. Cette approche s'adresse notamment aux projets qui ne sont pas compatibles avec les solutions 10X Genomics, par exemple à cause d'un nombre insuffisant de cellules.
scCUT&Tag/scChIP-seq
L'immunoprécipitation de la chromatine en cellules isolées (scChIP) et plus récemment le Cleavage Under Targets and Tagmentation en cellules isolées (scCUT&Tag) permettent de déterminer au niveau de la cellule unique comment les marques de chromatine spécifiques sont distribuées à travers le génome. Les marques associées à la chromatine activement transcrite, telle que la triméthylation H3 lysine 4 (H3K4me3), ou associées à la répression, telle que la triméthylation H3 lysine 27 (H3K27me3) peuvent être cartographiées dans chaque cellule et fournir des informations sur les types et états cellulaires, l'organisation de la chromatine et régulation de l'expression des gènes.
scCUT&Tag and scChIP-seq sur la plateforme Custom Single Cell Omics
La plateforme Custom Single Cell Omics met en place le scCUT&Tag et le ChIP-seq à cellule unique pour H3K4me3 et H3K27me3 sur des échantillons frais (lignées cellulaires et PDX). Le scCUT&Tag peut être combiné au séquençage d'ARN cytoplasmiques de la même cellules, permettant ainsi d'intégrer des données single cell épigénétiques et transcriptomiques.
scATACseq/RNA-seq combinés
La combinaison scATACseq/RNA-seq permet d’étudier simultanément l'expression des gènes et les régions ouvertes de la chromatine, et ainsi d'intégrer deux couches complémentaires d'informations (épi)génomiques dans chaque cellule, en corrélant l'accessibilité de la chromatine avec l'expression des gènes.
scATAC-seq/RNA-seq sur la plateforme NGS
La combinaison sc ATAC-seq/RNA-seq est disponible sur la plate-forme NGS à l'aide du pipeline 10X Genomics. Le matériel d'entrée requis est de 1 000 à 20 000 noyaux et le taux de récupération (rendement) est d'environ 50 % des noyaux chargés. Les recommandations de séquençage sont d'environ 25 000 paires de reads par noyau.
Image : 10X Genomics
scATAC-seq/RNA-seq sur la plateforme Custom Single Cell Omics
La plateforme Custom Single Cell Omics met en place une approche en plaque combinant l'ATAC-seq et le FLASH-seq pour mesurer l'accessibilité de la chromatine avec l'expression des gènes dans les mêmes cellules. Cette approche s'adresse notamment aux projets qui ne sont pas compatibles avec les solutions 10X Genomics, par exemple à cause d'un nombre insuffisant de cellules.
Single cell Phenotyping
Cytométrie conventionnelle
La cytométrie conventionnelle repose sur la mesure de fluorescence dans des canaux ciblés consécutivement à une excitation par un ou plusieurs lasers. Cette technique permet de mesurer et de corréler entre eux l’expression de jusqu’à 26 marqueurs.
Cytométrie conventionnelle à la plateforme de cytométrie
Neuf cytomètres conventionnels sont disponibles sur la plateforme de cytométrie. Possédant des caractéristiques et configurations différentes (max 5 lasers et 28 paramètres) mais complémentaires, le choix d’utilisation se fait en fonction des applications.
Cytométrie spectrale
La cytométrie spectrale a des capacités de collecte optique et d'analyse uniques. Alors que dans la cytométrie conventionnelle, des miroirs et des filtres séparent des bandes étroites de lumière vers des détecteurs individuels, en cytométrie spectrale, le spectre d'émission complet est capturé. La cytométrie spectrale permet ainsi d'étudier simultanément un plus grand nombre de paramètres qu'avec la cytométrie classique.
Cytométrie spectrale à la plateforme de cytométrie
Des cytomètres spectraux Aurora sont disponibles sur les plateforme cytométrie à Paris et à St Cloud. Leur configuration permet l'analyse de 50 marqueurs différents et la soustraction automatique de l'autofluorescence.
Cytométrie en image
La cytométrie en flux d'imagerie combine les caractéristiques de la cytométrie en flux avec la microscopie. Il permet l'intégration de données morphologiques et fluorescentes au niveau d'une seule cellule.
Cytométrie en image à la plateforme de cytométrie
La technologie ImageStream X MKII (IMSX) est disponible sur la plateforme de cytométrie. Cette technologie innovante permet l'acquisition de jusqu'à 12 canaux (4 lasers : 405 nm, 488 nm, 561 nm et 638 nm), l'ImageStream est équipé de 2 caméras, imageant chaque cellule avec une haute résolution (grossissement jusqu'à 60X). L'IMSX combine les informations morphologiques des cellules individuelles fournies par la microscopie standard (forme, localisation, cycle cellulaire, etc.) avec une grande taille d'échantillon et une robustesse statistique.
Omiques spatiales
Les technologies « spatiales » regroupent différentes technologies permettant d’obtenir des données -omiques sur des tissus tout en gardant l’information de la localisation spatiale au sein du tissu. Au-delà de l'identification de sous-populations moléculaires de cellules, ces approches renseignent également sur la localisation de ces sous-populations identifiées au sein du tissu d'origine, leur proximité entre elles et avec la matrice extracellulaire, les vaisseaux sanguins et autres composants tissulaires.
L’Initiative Single Cell a mis en place plusieurs technologies spatiales, en collaboration avec la plateforme de pathologie expérimentale ("PATHEX", Renaud Leclère et André Nicolas) :
Transcriptomique spatiale
La transcriptomique spatiale est une technologie révolutionnaire qui permet de mesurer l’expression des gènes dans un tissu et d’en cartographier la position au sein du tissu. Il combine une analyse d'ARNm avec un contexte morphologique dans des sections de tissus intacts, offrant une vue auparavant inaccessible de la biologie des tissus.
Transcriptomique spatiale basée sur le séquençage
La plateforme NGS et PATHEX ont implémenté les technologies de Visium et Visium HD de 10X Genomics. Basé sur le séquençage, elles ont l’avantage d’offrir une analyse du transcriptome entier, mais elles ne permettent pas une réelle détection des cellules uniques et de leurs contours. La résolution est d’environ 55 microns (Visium) ou 2 à 8 microns (Visium HD).
Dans ces technologies, des coupes de tissus congelés ou FFPE sont placées en face d’une lame contenant des millions d'oligonucléotides de capture avec des codes-barres spatiaux uniques à chaque localisation. Cette étape est réalisée avec un équipement dédié, le CytAssist de 10X Genomics. Après perméabilisation du tissu, les ARNm sont libérés, se lient aux oligos de capture et sont reverse transcrits. Les ADNc générées sont ensuite utilisées pour construire des banques Illumina qui sont séquencées à la plate-forme NGS. Les données d'expression sont superposées sur une image à haute résolution du tissu, permettant de visualiser l'expression des ARNm dans la morphologie du tissu.
Image: 10X Genomics
Transcriptomique spatiale basée sur l'imagerie
Un Xenium de 10X Genomics est disponible à la plateforme de Cytométrie. Il s'agit d'un système de transcriptomique spatiale basé sur l'imagerie qui permet de visualiser des centaines d'ARN au niveau moléculaire dans leur contexte tissulaire. Le système est basé sur l'hybridation et l'amplification in situ d'un panel ciblé de gènes d'intérêt, qui sont ensuite lus par des séries séquentielles d'imagerie. La taille des panels de gènes varie de 50 à 5000 gènes. Ces panels peuvent être entièrement personnalisés, standards pour un tissu d'intérêt ou une combinaison des deux. Des images en fond clair (telles que H&E) ou des images d'immunofluorescence peuvent être prises sur les mêmes sections par la suite afin d'obtenir un contexte tissulaire plus approfondi.
Téléchargez le flyer ici!
La force du Xenium réside dans sa résolution subcellulaire et sa grande sensibilité pour les transcrits rares et les cellules rares. De plus, une lame analysée sur le Xenium peut ensuite être analysée en Visium, Visium HD ou sur l’Orion (protéomique spatiale), offrant la possibilité de faire de la multi-omique spatiale.
En complément de l'approche commerciale proposée par le Xenium, Antoine Coulon et Kyra Borgman développent une approche de FISH multiplexé interne et à façon, qui sera particulièrement adaptée aux projets qui ne sont pas compatibles avec les solutions commerciales ou qui ne nécessitent pas un multiplexage élevé.
Protéomique spatiale
La protéomique spatiale combine la détection de plusieurs protéines, généralement grâce à l'utilisation d'anticorps spécifiques, avec la microscopie des tissus. Il permet l'intégration des données morphologiques et des données d'expression protéique au niveau de la cellule unique.
Protéomique spatiale à la plateforme Cytométrie
La plateforme de cytométrie propose la technologie Orion de Rarecyte, un nouveau système d'imagerie tissulaire par immunofluorescence multiplexée (jusqu’à 18 marqueurs actuellement). Ce système permet d'établir des profils phénotypiques complets et de caractériser des coupes de tissus entiers, en quelques heures et à une résolution subcellulaire. Il est basé sur une méthode de coloration non itérative: toutes les protéines sont marquées en une seule fois, ce qui permet de gagner du temps et d'éviter d'endommager le tissu par de cycles de marquage et d’effaçage. Des images en fond clair (telles que H&E) peuvent être prises sur les mêmes sections.
Un scanner de lames Nanozoomer est également disponible pour les mises au point de marquage ou les marquages qui ne nécessitent pas de multiplexage.
Lung cancer tissue imaged with the Orion
Analyse de données
Analyse des données Single Cell
La plateforme bioinformatique fait partie intégrante de l’Initiative Single Cell, où elle a plusieurs missions :
Contrôle qualité et analyse de premier niveau
Pour chaque application single cell, notre équipe de bioinformaticiens conçoit des pipelines bioinformatiques dédiés afin de vérifier la qualité des données, et de fournir une analyse de premier niveau. Les contrôles qualité sont mis en place en étroite collaboration avec les plateformes de Custom Single Cell Omics et de séquençage, afin de mettre en évidence les métriques clés des expériences, et sont ensuite résumés dans un rapport compréhensif.
Ces pipelines bioinformatiques sont exécutés automatiquement lorsque les données sont collectées à partir de la plate-forme de séquençage, fournissant les résultats en quelques heures. De plus, tous ces pipelines sont partagés (https://gitlab.curie.fr/sc-platform) et sont disponibles pour tous les collaborateurs au sein (et souvent en dehors) de l'institut. Ils sont tous développés selon les principes FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable), sont documentés et conditionnés pour faciliter leur utilisation.
Conception d'expériences et analyse avancée
En plus des contrôles de qualité standard et des analyses de premier niveau, la plateforme bioinformatique peut suivre votre projet à toutes les étapes du processus. Avant de commencer l'expérience, nous serons heureux de discuter avec vous de votre plan d'expérimentation afin d'être sûr que vous serez en mesure de répondre (statistiquement) à vos questions biologiques. En cas de besoin, la plateforme de bioinformatique peut également prendre en charge l'analyse en aval de votre projet en dédiant un bioinformaticien à votre projet pour une durée déterminée. De la même manière, les co-tutelles sont les bienvenues entre la plateforme et les équipes de recherche afin de partager l'expertise et les connaissances sur le terrain.
Formation et networking
Enfin, la plateforme de bioinformatique est impliquée dans plusieurs réseaux dédiés à l'analyse de données single cell, couvrant de nombreux aspects différents du domaine, du traitement des données aux méthodes statistiques avancées. A titre d'exemple, nous faisons partie du groupe de travail sinCellTE qui organise chaque année un atelier monocellulaire dédié aux bioinformaticiens et analystes du domaine.
Événements scientifiques
Orateurs : Leanne DE KONING, Abdelaziz Bouali, Melissa Saichi, Jeremy Mesple, Manuel Rodrigues, Pierre Bost
Orateurs : Wilfred Van IJcken
Orateurs : Louise Leijonancker
Orateurs : Abdelaziz Bouali, Cécilia Korol
