Stress et Cancer

Depuis plusieurs années, notre équipe de recherche s’attache à caractériser le microenvironnement tumoral, notamment dans les cancers du sein et de l’ovaire. Les fibroblastes associés au cancer ou CAF (Cancer Associated Fibroblast) constituent l’un de ses composants abondants. Leur rôle au sein des tumeurs a longtemps été sous-estimé. Les CAF exercent pourtant des fonctions pro-tumorales clefs : ils favorisent la progression et la dissémination des cellules tumorales; ils participent également à déjouer la surveillance du système immunitaire. Et ils sont enfin impliqués dans la résistance aux traitements. 

1. Hétérogénéité des CAF dans les cancers

Compte tenu du rôle important des CAF dans les cancers (Toullec et al., EMBO Mol. Med. 2010 ; Costa et al., Seminars in Cancer Biology, 2014; Mhaidly et al, Seminars in Immunology, 2020; Mhaidly et al, Immunol Rev, 2021), nous avons entrepris de caractériser leur hétérogénéité au sein du microenvironnement tumoral. Caractériser l’hétérogénéité des CAF est un enjeu majeur afin de réaliser une cartographie précise des tumeurs et comprendre leurs fonctions distinctes au sein de la niche tumorale, tout au long de la progression cancéreuse, et lors du traitement des patients. L’identification et la définition précise de sous-populations fibroblastiques ayant un rôle clé dans l’échappement tumoral et la résistance au traitement permettront de proposer de nouvelles pistes diagnostiques et thérapeutiques dont pourraient bénéficier les patients.

Grâce à l’analyse d’échantillons de patientes nous avons identifié 4 sous-populations de CAF (dénommées CAF-S1, -S2, -S3, -S4) dans les cancers du sein et de l’ovaire (Costa et al, Cancer Cell, 2018 ; Givel et al, Nature Communications, 2018).  Chacune de ces populations de CAF est caractérisée par l’expression de marqueurs spécifiques. De manière intéressante, ces sous-populations de CAF s’accumulent dans des proportions distinctes en fonction des sous-types de cancers du sein (Luminal, HER2 et Triple-Négative) et de l’ovaire (mésenchymateux/non-mésenchymateux). Ainsi, les CAF-S2 et CAF-S3 sont non seulement observés dans les tumeurs, mais aussi dans les tissus juxta-tumoraux normaux, suggérant qu’ils pourraient provenir de fibroblastes normaux détectés dans les tissus sains.  Au contraire, les myofibroblastes CAF-S1 et CAF-S4 sont présents exclusivement dans les tumeurs. Par ailleurs, les deux populations myofibroblastiques CAF-S1 et CAF-S4 s’accumulent dans des cancers agressifs ce qui suggère qu’ils jouent un rôle majeur dans la progression tumorale.

Ces 4 sous-types de CAF sont également détectés dans d’autres cancers, ce qui souligne leur relevance biologique (Kieffer et al, Cancer Discovery, 2020).

The 4 CAF subsets (CAF-S1 to CAF-S4) differentially accumulate between breast cancer subtypes. LumA BC = luminal A breast cancer, HER2 BC = HER2 positive breast cancer, TN BC: triple negative breast cancer (Costa et al, Cancer Cell, 2018).

2. Fonctions des fibroblastes CAF-S1 et CAF-S4 dans les cancers

Les fibroblastes CAF-S1 (SMA⁺ FAP⁺ CD29^med-high) possèdent à la fois des fonctions immunosuppressiveset pro-métastatiques (Costa et al, Cancer Cell, 2018; Givel et al, Nature Communications, 2018; Bonneau et al, Breast Cancer Research, 2020; Pelon et al, Nature communications, 2020 ; Kieffer et al, Cancer Discovery, 2020).

• Les fibroblastes CAF-S1 sont immunosuppresseurs

Nos études sur les cancers du sein et de l’ovaire ont démontré que les fibroblastes CAF-S1 sont capables de réduire l’activité de défense du système immunitaire. Les CAF-S1 favorisent l’attraction des lymphocytes T et stimulent leur différenciation en lymphocytes T régulateurs au détriment des lymphocytes T cytotoxiques, entrainant ainsi un microenvironnement immunosuppresseur. En effet, en sécrétant la chimiokine CXCL12, les fibroblastes CAF-S1 attirent les lymphocytes CD4+ CD25+ puis les retiennent grâce aux ligands OX40L, PD-L2 et JAM2 exprimés à leur surface. Enfin les CAF-S1 induisent la différenciation de ces lymphocytes CD4+ CD25+ en lymphocytes T régulateurs (FOXP3+) qui entrainent la diminution de la prolifération des cellules T effectrices (Costa et al, Cancer Cell, 2018 ; Givel et al, Nature Communications, 2018 ; Brevet WO2019020728A1).  

Les fibroblastes CAF-S1 induisent un microenvironnement immunosuppresseur par l’attraction des lymphocytes T dans leur voisinage, leur séquestration et leur différentiation en lymphocytes T régulateurs caractérisés par une forte expression de FOXP3.

• Les fibroblastes CAF-S1 et CAF-S4 stimulent la propagation métastatique par des mécanismes complémentaires

Après avoir caractérisé les populations de CAF dans les tumeurs primaires, nous avons étudié la composition fibroblastique des métastases axillaires lymphatiques chez les patientes atteintes de cancers du sein. Nous avons observé que les 4 populations de CAF (CAF-S1, -S2, -S3, -S4) sont détectées dans les nodules lymphatiques métastatiques mais les proportions de fibroblastes CAF-S1 et CAF-S4 sont corrélées au nombre de cellules tumorales envahissant le tissu. Ainsi, les fibroblastes CAF-S1 et CAF-S4 s’accumulent non seulement dans les tumeurs agressives, mais également dans les nodules lymphatiques métastatiques. Enfin, le contenu en CAF-S1 et CAF-S4 dans ces nodules est un nouveau marqueur de mauvais pronostic, indiquant -au moment du diagnostic- un risque élevé de récidive tardive et de métastases à distance (Pelon et al, Nature Communications, 2020).

Par des analyses fonctionnelles combinant des expertises interdisciplinaires en Biologie et Physique, nous avons démontré que les fibroblastes CAF-S1 et CAF-S4 exercent des activités pro-métastatiques et coopèrent grâce à des mécanismes complémentaires. Les CAF-S1 initient la transition des cellules cancéreuses épithéliales en cellules mésenchymateuses et stimulent leur migration ; les CAF-S4 promeuvent leur capacité d’invasion, démontrant ainsi les actions synergiques de ces deux sous-populations dans le développement métastatique (Pelon et al, Nature Communications, 2020). 

Les fibroblastes CAF-S1 et CAF-S4 coopèrent pour induire la formation de métastases en jouant sur la prolifération, la migration et la transition épithélio-mésenshymateuse d’une part et sur les propriétés invasives des cellules cancéreuses d’autre part (Pelon et al, Nature Communications, 2020).

Les cancers du sein luminaux précoces T1N0 (tumeurs inférieures à 2cm) sont peu étudiés car le plus souvent de bon pronostic. Cependant, dans 5% des cas, ce cancer progresse avec le développement de métastases entrainant la rechute thérapeutique des patientes. D’un point de vue clinique, il est donc primordial d’anticiper ces réponses afin de développer de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous avons comparé un groupe de patientes ayant rechutées, et un groupe « contrôle » n’ayant pas développé de métastases. Or, les patientes qui ont développé des métastases possèdent, au sein de leur tumeur primaire, un enrichissement de fibroblastes CAF-S1. Cette étude montre, une nouvelle fois, que les fibroblastes CAF-S1 sont un marqueur de mauvais pronostic et associé à un risque élevé de récidive. Les métastases issues des cancers du sein luminaux sont majoritairement osseuses. Or, les fibroblastes CAF-S1 participent activement à la formation de métastases en induisant la migration des cellules tumorales par l’action de la cadhérine ostéoblastique CDH11 (Bonneau et al, Breast Cancer Research, 2020).

3. Hétérogénéité cellulaire des fibroblastes CAF-S1 dans les cancers du sein

• Identification de sous-populations cellulaires CAF-S1

Les fibroblastes CAF-S1 possèdent à la fois des fonctions pro-métastatiques et immunosuppressives. Compte tenu de ces observations, nous avons entrepris de caractériser en profondeur l’hétérogénéité des CAF-S1, grâce à des analyses de séquençage sur cellule unique (single-cell RNAseq). Le séquençage de plus de 18.000 fibroblastes CAF-S1 isolés de cancers du sein nous a permis d’identifier 8 clusters cellulaires différents, associé à des signatures spécifiques. Parmi ces 8 sous-populations, 5 clusters sont des CAF myofibroblastiques ou myCAF (clusters ECM-myCAF, wound-myCAF, TGFβ-myCAF, INF⍺/β-myCAF et acto-myCAF). Les 3 autres clusters de fibroblastes CAF-S1 sont apparentés aux CAF « inflammatoires » ou iCAF (detox-iCAF, il-iCAF, IFN𝛾-iCAF), caractérisés par une forte expression de molécules pro-inflammatoires et de chimiokines (Kieffer et al, Cancer Discovery, 2020).

Représentation UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) de l’analyse du séquençage sur cellule unique (scRNA-seq) de la population fibroblastique CAF-S1 montrant la présence de 8 clusters cellulaires distincts ayant un profil transcriptomique et des propriétés spécifiques (Kieffer et al, Cancer Discovery, 2020).

• Les clusters ECM-myCAF et TGFβ-myCAF induisent un microenvironnement immunosuppresseur

Compte tenu de la fonction immunosuppressive des CAF-S1, nous avons démontré que cette propriété était, en fait, portée spécifiquement par certains clusters. En effet, nous avons montré que les fibroblastes ECM-myCAF et TGFβ-myCAF sont corrélés à la présence de lymphocytes T régulateurs (CD4+ Treg) et inversement corrélés à la présence de lymphocytes T cytotoxiques (CD8+), démontrant leur association avec un environnement immunosuppresseur enrichis en Treg. En étudiant les mécanismes moléculaires impliqués dans cette association nous avons mis à jour une interaction réciproque entre les fibroblastes ECM-myCAF, TGFβ-myCAF et les Treg :

1. Les fibroblastes ECM-myCAF jouent sur la proportion de Treg (CD4+ CD25+ FOXP3+) en augmentant l’expression des protéines PD-1 et CTLA-4 à la surface de ces cellules.
2. En retour, les Treg promeuvent la conversion des fibroblastes ECM-myCAF en TGFβ-myCAF (Kieffer et al, Cancer Discovery, 2020).

• Les clusters ECM-myCAF, TGFβ-myCAF et wound-myCAF sont indicatifs de la résistance aux immunothérapies

Compte tenu de leur rôle dans la régulation de PD-1 et CTLA-4, nous avons étudié si ces clusters fibroblastiques pouvaient être prédictifs de la réponse aux immunothérapies, chez des patients atteints de mélanomes et de cancers du poumon non-à-petites cellules (NSCLC) métastatiques. De manière très intéressante, les clusters fibroblastiques ECM-myCAF, TGFβ-myCAF et wound-myCAF sont enrichis au diagnostic chez les patients ne répondant pas à l’immunothérapie, suggérant que les fibroblastes ECM-myCAF, TGFβ-myCAF et wound-myCAF sont prédictifs de la résistance aux immunothérapies dans les cancers (Kieffer et al, Cancer Discovery, 2020 ; Brevet EP20305454).  Ainsi, nos analyses suggèrent que cibler le microenvironnement tumoral et en particulier les clusters de CAF-S1 pourrait être une stratégie thérapeutique pertinente, en combinaison avec les traitements actuels et notamment l’immunothérapie.

Interaction réciproque entre les clusters de fibroblastes CAF-S1 ECM-myCAF, TGFβ-myCAF et les lymphocytes T. (1) Les fibroblastes CAF-S1 sont hétérogènes, composés de 8 clusters fibroblastiques distincts. (2-3) Les fibroblastes ECM-myCAF et TGFβ-myCAF sont associés à un microenvironnement immunosuppresseur, enrichis en lymphocytes T régulateurs. Les fibroblastes ECM-myCAF augmentent l’expression…

Cette étude a permis un niveau d’analyse et de caractérisation des CAF jusqu’alors jamais atteint et rend compte de la complexité de cette population cellulaire au sein des tumeurs. Les interactions entre ces différents clusters cellulaires avec les cellules immunitaires et cancéreuses nous permettent d’avoir une vision intégrée de la biologie des tumeurs et une compréhension plus complète des mécanismes induisant leur dérégulation. Ces découvertes démontrent le rôle majeur des CAF dans la progression cancéreuse et les mécanismes de résistance aux traitements et permettent de mettre à jour de nouveaux leviers diagnostique et thérapeutiques pour les patients atteints de cancers.

4. Myofibroblastes et rigidité tumorale dans les cancers ovariens

Les cancers de l’ovaire séreux de haut grade ou HGSOC (High Grade Serous Ovarian Cancer) font partis des cancers gynécologiques les plus agressifs, en particulier pour les patientes atteintes de sous-type moléculaire mésenchymateux, identifié notamment par notre laboratoire (Mateescu et al., Nature Medicine, 2011 ; Batista et al., Nature Communications, 2016 ; Kieffer et al., Frontiers in Genetics, 2020). Ces patientes sont caractérisées par un fort contingent de myofibroblastes et une accumulation des protéines de la matrice extracellulaire (Givel et al, Nature Communications, 2018 ; Mieulet et al, Scientific Reports, 2021). Les myofibroblastes sont des fibroblastes activés, contractiles, exprimant de façon constitutive l’actine musculaire lisse. Nous avons caractérisé le rôle de ce contingent myofibroblastique dans la rigidité et l’agressivité tumorale. Nous avons observé une différence majeure en fonction du sous-type moléculaire de HGSOC : les tumeurs mésenchymateuses présentent une plus forte rigidité au cours de la croissance tumorale que les tumeurs non-mésenchymateuses. En effet la rigidité des tumeurs mésenchymateuse est directement associée au contingent myofibroblastique. Plus les tumeurs sont enrichies en CAF myofibroblastiques, plus elles présentent une forte densité de collagène et plus elles sont rigides. De plus, notre étude démontre que la rigidité induite par l’enrichissement myofibroblastique joue un rôle central dans l’agressivité des tumeurs ovariennes car elle corrèle avec l’activation de la voie MAPK/MEK et entraine un switch métabolique glycolytique, à la fois des cellules tumorales épithéliales et des cellules stromales (Mieulet et al, Scientific Reports, 2021).

5. Perspectives de recherche :

Les questions soulevées par ces récentes découvertes nous poussent à explorer et caractériser davantage l’hétérogénéité des fibroblastes CAF-S1. Déterminer la cellule d’origine et les mécanismes par lesquels la diversité cellulaire de la population CAF-S1 est générée est une des questions centrales de nos études grâce au développement de techniques de pointe, dont séquencage ARN sur cellule unique, transcriptomique spatiale et immunohistochimie multiplex. Réaliser une cartographie fine du microenvironnement tumoral dans le temps et dans l’espace nous permettra de rendre compte des affinités et interactions entre les différents types cellulaires composant la niche tumorale et ainsi déterminer leur rôle dans la progression cancéreuse et la résistance aux traitements. La caractérisation complète du microenvironnement tumoral nous permettra de proposer de nouvelles pistes diagnostiques et thérapeutiques aux patients atteints de cancer.

Publications associées de l’équipe :

• Mhaidly, R. and Mechta-Grigoriou F. Inflammatory fibroblasts make rectal cancer resistant to radiation therapy." Cancer Cell, 2022 40(2): 122-124. https://doi.org/10.1016/j.ccell.2022.01.005
• Peltier, A., Seban RD., Bidard FC., Buvat I., Mechta-Grigoriou F. Fibroblast heterogeneity in solid tumors: From single cell analysis to whole-body imaging. Seminars in Cancer Biology, 2022 https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2022.04.008 
• Mhaidly, R.; Mechta-Grigoriou, F. Role of Cancer-Associated Fibroblast Subpopulations in Immune Infiltration, as a New Means of Treatment in Cancer. Immunol Rev 2021. https://doi.org/10.1111/imr.12978.
• Mieulet, V.; Garnier, C.; Kieffer, Y.; Guilbert, T.; Nemati, F.; Marangoni, E.; Renault, G.; Chamming’s, F.; Vincent-Salomon, A.; Mechta-Grigoriou, F. Stiffness Increases with Myofibroblast Content and Collagen Density in Mesenchymal High Grade Serous Ovarian Cancer. Scientific Reports 2021, 11 (1), 4219. https://doi.org/10.1038/s41598-021-83685-0.
• Mhaidly, R.; Mechta-Grigoriou, F. Fibroblast Heterogeneity in Tumor Micro-Environment: Role in Immunosuppression and New Therapies. Seminars in Immunology 2020, 101417. https://doi.org/10.1016/j.smim.2020.101417.
• Kieffer, Y.; Hocine, H. R.; Gentric, G.; Pelon, F.; Bernard, C.; Bourachot, B.; Lameiras, S.; Albergante, L.; Bonneau, C.; Guyard, A.; Tarte, K.; Zinovyev, A.; Baulande, S.; Zalcman, G.; Vincent-Salomon, A.; Mechta-Grigoriou, F. Single-Cell Analysis Reveals Fibroblast Clusters Linked to Immunotherapy Resistance in Cancer. Cancer Discovery 2020, 10 (9), 1330–1351. https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-19-1384.
• Kieffer, Y.; Bonneau, C.; Popova, T.; Rouzier, R.; Stern, M.-H.; Mechta-Grigoriou, F. Clinical Interest of Combining Transcriptomic and Genomic Signatures in High-Grade Serous Ovarian Cancer. Frontiers in Genetics 2020, 11. https://doi.org/10.3389/fgene.2020.00219.
• Bonneau, C.; Eliès, A.; Kieffer, Y.; Bourachot, B.; Ladoire, S.; Pelon, F.; Hequet, D.; Guinebretière, J.-M.; Blanchet, C.; Vincent-Salomon, A.; Rouzier, R.; Mechta-Grigoriou, F. A Subset of Activated Fibroblasts Is Associated with Distant Relapse in Early Luminal Breast Cancer. Breast Cancer Research 2020, 22 (1), 76. https://doi.org/10.1186/s13058-020-01311-9.
• Pelon, F.; Bourachot, B.; Kieffer, Y.; Magagna, I.; Mermet-Meillon, F.; Bonnet, I.; Costa, A.; Givel, A.-M.; Attieh, Y.; Barbazan, J.; Bonneau, C.; Fuhrmann, L.; Descroix, S.; Vignjevic, D.; Silberzan, P.; Parrini, M. C.; Vincent-Salomon, A.; Mechta-Grigoriou, F. Cancer-Associated Fibroblast Heterogeneity in Axillary Lymph Nodes Drives Metastases in Breast Cancer through Complementary Mechanisms. Nature Communications 2020, 11 (1), 404. https://doi.org/10.1038/s41467-019-14134-w.
• Costa, A.; Kieffer, Y.; Scholer-Dahirel, A.; Pelon, F.; Bourachot, B.; Cardon, M.; Sirven, P.; Magagna, I.; Fuhrmann, L.; Bernard, C.; Bonneau, C.; Kondratova, M.; Kuperstein, I.; Zinovyev, A.; Givel, A.-M.; Parrini, M.-C.; Soumelis, V.; Vincent-Salomon, A.; Mechta-Grigoriou, F. Fibroblast Heterogeneity and Immunosuppressive Environment in Human Breast Cancer. Cancer Cell 2018, 33 (3), 463-479.e10. https://doi.org/10.1016/j.ccell.2018.01.011.
• Givel, A.-M.; Kieffer, Y.; Scholer-Dahirel, A.; Sirven, P.; Cardon, M.; Pelon, F.; Magagna, I.; Gentric, G.; Costa, A.; Bonneau, C.; Mieulet, V.; Vincent-Salomon, A.; Mechta-Grigoriou, F. MiR200-Regulated CXCL12β Promotes Fibroblast Heterogeneity and Immunosuppression in Ovarian Cancers. Nature Communications 2018, 9. https://doi.org/10.1038/s41467-018-03348-z.
• Batista, L.; Bourachot, B.; Mateescu, B.; Reyal, F.; Mechta-Grigoriou, F. Regulation of MiR-200c/141 Expression by Intergenic DNA-Looping and Transcriptional Read-Through. Nature Communications 2016, 7. https://doi.org/10.1038/ncomms9959.
• Costa, A.; Scholer-Dahirel, A.; Mechta-Grigoriou, F. The Role of Reactive Oxygen Species and Metabolism on Cancer Cells and Their Microenvironment. Seminars in Cancer Biology 2014, 25, 23–32. https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2013.12.007.
• Mateescu, B.; Batista, L.; Cardon, M.; Gruosso, T.; de Feraudy, Y.; Mariani, O.; Nicolas, A.; Meyniel, J.-P.; Cottu, P.; Sastre-Garau, X.; Mechta-Grigoriou, F. MiR-141 and MiR-200a Act on Ovarian Tumorigenesis by Controlling Oxidative Stress Response. Nature Medicine 2011, 17 (12), 1627–1635. https://doi.org/10.1038/nm.2512.

Toullec, A.; Gerald, D.; Despouy, G.; Bourachot, B.; Cardon, M.; Lefort, S.; Richardson, M.; Rigaill, G.; Parrini, M.-C.; Lucchesi, C.; Bellanger, D.; Stern, M.-H.; Dubois, T.; Sastre-Garau, X.; Delattre, O.; Vincent-Salomon, A.; Mechta-Grigoriou, F. Oxidative Stress Promotes Myofibroblast Differentiation and Tumour Spreading

1. Role du stress oxydant dans la chimiosensibilité

La caractérisation de la diversité (transcriptomique, protéique, métabolomique, …) des cellules tumorales dans les cancers représente un défi majeur pour mieux comprendre le développement tumoral, les interactions cellulaires et les mécanismes de résistance aux traitements et ainsi participer à une meilleure prise en charge thérapeutique des patients atteints de cancer. Historiquement, le laboratoire « Stress et Cancer » s’intéresse au lien entre le stress oxydant, le vieillissement cellulaire et le développement tumoral. En effet, le cancer étant l’une des pathologies les plus fréquentes du vieillissement, nous nous sommes intéressés à l’impact d’un stress oxydant persistant sur le développement tumoral. Nous avons ainsi démontré que :

• Le stress oxydant stimule la croissance et la dissémination métastatique, en modifiant en profondeur le microenvironnement tumoral via l’action de la chimiokine CXCL12 et du facteur pro-angiogénique HIF dans les cancers du sein invasifs HER2-positif (Gerald et al, Cell, 2004 ; Toullec et al, EMBO Molecular Medicine, 2010 ; Dahirel et al, Cell cycle, 2013 ; Costa et al, Seminars Cancer Biology, 2014).
• Le stress oxydant favorise la réponse aux chimiothérapies chez les patientes atteintes de carcinomes ovariens séreux de haut grade (HGSOC). Les patientes atteintes de HGSOC sont classiquement inclues dans un protocole thérapeutique comprenant de la chimiothérapie de type taxanes et sels de platine, génératrices d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de dommages à l’ADN. L’impact positif du stress oxydant dans la réponse aux chimiothérapies est caractérisé par l’action de la famille de micro-ARN miR-200. Nous avons ainsi mis en évidence deux groupes de patientes atteintes de HGSOC : le premier est caractérisé par un stress oxydant et une meilleure réponse à la chimiothérapie, le second, fibreux de plus mauvais pronostic (Mateescu et al, Nature Medicine, 2011 ; Batista et al, International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 2013 ; Batista et al, Nature Communications, 2016).

L’étude du stress oxydant chez les patientes atteintes de cancer de l’ovaire séreux de haut grade (HGSOC) a permis de mettre en évidence deux groupes de patientes : « stress oxydant » et « fibreux ». Les patientes ayant un profil transcriptomique révélant un enrichissement de gènes impliqués dans la réponse au stress oxydant possède une meilleure réponse à la chimiothérapie et sont de meilleur…

Les HGSOC font partis des cancers gynécologiques les plus agressifs. En lien direct avec la réponse au stress oxydant, nous avons mené deux études en parallèle au laboratoire qui rendent compte de l’hétérogénéité des cellules tumorales dans ces cancers, sous deux aspects : le métabolisme cellulaire et la voie de signalisation induite par MAP3K8.

2. Hétérogénéité métabolique et chimiosensibilité des cellules tumorales ovariennes :

La reprogrammation métabolique est définie comme une des caractéristiques ou « Hallmark » des tumeurs (Gentric et al, Antioxydants and Redox Signaling, 2017, Gentric & Mechta-Grigoriou, Cancers 2021). En combinant des approches protéomiques, métabolomiques et fonctionnelles (Seahorse, ¹³C-fluxomique, siRNA, xénogreffes), nous avons identifié une signature métabolique qui distingue 2 sous-groupes de tumeurs, low-OXPHOS et high-OXPHOS. Les tumeurs low-OXPHOS sont dépendantes de la glycolyse aérobie ou « Effet Warburg » tandis que les tumeurs high-OXPHOS utilisent la phosphorylation oxydative (OXPHOS). Ces résultats soulignent, pour la première fois, l’hétérogénéité métabolique inter-tumoraledans les cancers de l’ovaire (Gentric et al, Cell Metabolism, 2019).

De manière intéressante, bien qu’aucune altération génomique spécifique n’ait été identifiée dans les tumeurs high-OXPHOS, ce statut semble être associé à une déficience des mécanismes de réparation de l’ADN, de type recombinaison homologue. Cette déficience en recombinaison homologue pouvant être associée à un stress oxydant chronique, nous avons démontré que les tumeurs « high-OXPHOS » sont caractérisées par un stress oxydant chronique qui promeut l’accumulation et l’agrégation d’un facteur PML (ProMyelocytic Leukemia) et induit l’activation du co-activateur de la biogenèse mitochondriale PGC1⍺ (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha). L’axe PML-PCG1⍺ promeut l’expression des gènes des complexes de la chaine respiratoire conduisant à l’augmentation de la respiration mitochondriale dans ces cellules (Gentric et al, Cell Metabolism, 2019).

Nous avons évalué l’impact du métabolisme tumoral sur la réponse à la chimiothérapie conventionnelle utilisée en clinique. L’étude de modèles précliniques a démontré que la signature « high-OXPHOS » est associée à une chimiosensibilité accrue aux traitements conventionnels (sels de platine et taxanes), indépendamment de la BRCAness. Chez les patientes atteintes de HGSOC, la forte expression des protéines ETC dans les tumeurs est associée à une meilleure survie. En collaboration avec l’équipe du Dr. Raphael Rodriguez à l’Institut Curie, nous avons démontré que la chimiosensibilité des cellules tumorales s’explique, en partie, par un processus dit ferroptose, mort cellulaire programmée dépendante du fer. Ainsi, les tumeurs « high-OXPHOS » sont caractérisées par une sensibilité accrue aux chimiothérapies qui repose sur l’accumulation de ROS, l’altération des mitochondries et l’induction de la ferroptose (Gentric et al, Cell Metabolism, 2019).

Hétérogénéité OXPHOS dans les cancers de l’ovaire, médiée par un stress oxydant, qui favorise l’activation de l’axe PML- PGC-1 et induisant une chimiosensibilité (Gentric et al, Cell metabolism, 2019).

Perspectives de recherche :

Nos perspectives de recherche s’articulent autour de deux axes :

Nous souhaitons investiguer l’hétérogénéité métabolique intra-tumorale afin de faire le lien entre fonction moléculaire, propriété métabolique et localisation spatiale au sein de la tumeur. Nous souhaitons également déterminer les mécanismes à l’origine de la plasticité métabolique et les trajectoires des différents clones cellulaires. Enfin, nous caractériserons les interactions entre les différents clones cellulaires avec leur microenvironnement tumoral.

• Définir l’hétérogénéité cellulaire et métabolique des tumeurs ovariennes et ainsi faire le lien entre fonctions moléculaires, propriétés métaboliques et localisation spatiale au sein de la tumeur. Nous souhaitons également déterminer les mécanismes à l’origine de la plasticité métabolique et les trajectoires des différents clones cellulaires. Enfin, nous caractériserons les interactions entre les différents clones cellulaires avec leur microenvironnement tumoral.

• Déterminer les mécanismes moléculaires de résistance aux traitements (chimiothérapie conventionnelle, immunothérapies). En effet, bien que le statut high-OXPHOS soit associé à une meilleure réponse au traitement, la grande majorité des patientes atteintes de cancer de l’ovaire rechute après traitement, soulignant le besoin d’identifier les mécanismes de résistance au traitement. Nous souhaitons donc investiguer l’hétérogénéité métabolique intra-tumorale, notamment la plasticité métabolique induite après chimiothérapie.

3. L’étude de la voie de signalisation MAP3K8-MEK dans les HGSOC :

Dans la continuité de nos études relatives à la réponse au stress oxydant dans les cancers de l’ovaire, nous avons mis en évidence, par des études protéomiques l’accumulation de la protéine kinase MAP3K8, marqueur de mauvais pronostic, dans 50% des tumeurs HGSOC (Gruosso et al, Nature Communications, 2015). L’accumulation de MAP3K8 conduit à une activation constitutive de la voie de signalisation MEK/ERK en absence de mutation KRAS ou BRAF. Il existe donc une hétérogénéité inter-tumorale de la voie de signalisation MAP3K8/MEK chez les patientes atteintes de HGSOC. Nous avons montré que MAP3K8 exerce des fonctions pro-tumorigéniques médiées par MEK/ERK et que cette protéine kinase présente une valeur prédictive de l’efficacité des inhibiteurs de MEK. Ces travaux soulignent l’intérêt potentiel de l’utilisation des anti-MEK dans les cancers ovariens de haut-grade pour les patientes qui présentent une forte expression de MAP3K8, alors qu’ils sont pour l’instant testés uniquement dans les cancers ovariens de bas-grade mutés pour les oncogènes KRAS ou BRAF (Gruosso et al, Nature Communications, 2015 ; Brevet : EP14306434, 2015).

Perspectives de recherche :

La plupart des voies de signalisation oncogéniques incluant MEK/ERK conduisent à une reprogrammation traductionnelle du génome en activant eIF4F, complexe d’initiation de la traduction. Nous avons montré que l’activation constitutive de MEK/ERK, due à l’accumulation de MAP3K8 dans les HGSOC, contrôle la formation et l’activité du complexe eIF4F, induisant ainsi la traduction d’un ensemble d’ARNm spécifiques. Nous souhaitons désormais déterminer les causes et les conséquences de la reprogrammation traductionnelle induite par MAP3K8/MEK dans les HGSOC sur le développement tumoral et la réponse aux traitements.

4. Déchiffrer la résistance à la chimio-immunothérapie dans le cancer du poumon : rôle de la voie Hippo/YAP dans le micro-environnement tumoral

La cascade de signalisation Hippo/YAP (Figure) est hautement conservée au cours de l'évolution depuis drosophila melanogaster jusqu'à l'homme, car elle régule la taille des organes et l'homéostasie cellulaire au cours du développement normal, et particulièrement la différenciation épithéliale respiratoire et bronchique. Nous étudions l'implication de la voie Hippo/YAP et des signalisations qui y sont connectées (RAS/RHO, XPO1) dans la résistance à la chimiothérapie et l'immunothérapie chez les patients ayant un cancer broncho-pulmonaire ou un mesothéliome pleural.

Nous avions initialement rapporté que l'inactivation, par hyper-méthylation de son promoteur et perte d'hétérozygotie du chromosome 3p du gène suppresseur de tumeur RASSF1-A, qui code pour un régulateur négatif amont de la voie Hippo, prédisait de façon indépendante une survie plus courte des patients avec cancer bronchique non à petites cellules de stade précoce. Par la suite nous avons montré que l'inactivation de RASSF1-A par ARN interférent, conduisait à une accumulation nucléaire du co-activateur transcriptionnel YAP1 et son hyper-activation dans des cellules bronchiques normales immortalisées (HBEC-3). Cette activation de YAP passait par l'inactivation de la petite GTPase RHOB à la suite de la phosphorylation et inactivation de son facteur d'échange GDP/GTP, GEF-H1 (aka ARH-GEF 2), par la kinase SK38L (aka NDR2) une kinase de la famille des LATS kinases qui sont au cœur de la cascade Hippo (Dubois et al, 2016). Nous avons aussi rapporté la fréquence élevée de l'inactivation par méthylation de leur promoteur des gènes codant pour les kinases de la voie Hippo dans les mesothéliomes, qu'il s'agisse de MST1/Hippo elle-même, ou de LATS1/2. Plus récemment nous avons montré que YAP était transporté hors du noyau par le transporteur XPO-1, lui-même activé par phosphorylation par la kinase STK38, de la même façon que d'autres protéines tel l'acteur central de l'autophagie BECLIN (Martin et al, 2019). Plus récemment nous avons initié une collaboration avec la compagnie pharmaceutique INVENTIVA pour étudier l'effet d'inhibiteurs pharmacologiques de l'interaction de YAP avec son partenaire favori, le facteur de transcription TEAD. Nous explorons les mécanismes de résistance à la chimiothérapie à base de taxanes  (paclitaxel) ou aux inhibiteurs de point de contrôle immunitaires (anti-PD-1) dans des lignées de cancer bronchiques avec hyper-activation de YAP/TEAD, ou sur des cellules primaires du microenvironnement tumorale, isolées à partir de tumeurs pulmonaires fraiches (pièces de résection chirurgicale),  en utilisant un système microfluidique de co-cultures cellulaires 3D, ou ‘cancer du poumon sur puce' (collaboration avec les Services de chirurgie thoracique et anatomie pathologique de l'Hôpital Bichat, GHU AP-HP.Nord).

Voie HIPPO/YAP et modèle de sa régulation par RASSF1A/RHOB/GEF-H1

Publications associées de l’équipe :

• Gentric G., Mechta-Grigoriou F. Tumor Cells and Cancer-Associated Fibroblasts: An Updated Metabolic Perspective. Cancers2021 Jan 22;13(3):399. doi: 10.3390/cancers13030399.
• Gentric, G.; Kieffer, Y.; Mieulet, V.; Goundiam, O.; Bonneau, C.; Nemati, F.; Hurbain, I.; Raposo, G.; Popova, T.; Stern, M.-H.; Lallemand-Breitenbach, V.; Müller, S.; Cañeque, T.; Rodriguez, R.; Vincent-Salomon, A.; de Thé, H.; Rossignol, R.; Mechta-Grigoriou, F. PML-Regulated Mitochondrial Metabolism Enhances Chemosensitivity in Human Ovarian Cancers. Cell Metabolism2019, 29 (1), 156-173.e10. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2018.09.002.
• Martin AP, Jacquemyn M, Lipecka J, Chhuon C, Aushev VN, Meunier B, Singh MK, Carpi N, Piel M, Codogno P, Hergovich A, Parrini MC, Zalcman G, Guerrera IC, Daelemans D, Camonis JH.  TK38 kinase acts as XPO1 gatekeeper regulating the nuclear export of autophagy proteins and other cargoes. EMBO Rep. 2019 Nov 5;20(11):e48150.
• Gentric, G.; Mieulet, V.; Mechta-Grigoriou, F. Heterogeneity in Cancer Metabolism: New Concepts in an Old Field. Antioxidants and Redox Signaling 2017, 26 (9), 462–485. https://doi.org/10.1089/ars.2016.6750.
• Dubois F, Keller M, Calvayrac O, Soncin F, Hoa L, Hergovich A, Parrini MC, Mazieres J, Vaisse-Lesteven M, Camonis J, Levallet G, Zalcman G. RASSF1A suppresses the invasion and metastatic potential of human non-small cell lung cancer cells by inhibiting YAP activation through the GEF-H1/RhoB pathway. Cancer Res. 2016 Jan 12. pii: canres.1008.2015.
• Batista, L.; Bourachot, B.; Mateescu, B.; Reyal, F.; Mechta-Grigoriou, F. Regulation of MiR-200c/141 Expression by Intergenic DNA-Looping and Transcriptional Read-Through. Nature Communications 2016, 7. https://doi.org/10.1038/ncomms9959.
• Gruosso, T.; Garnier, C.; Abelanet, S.; Kieffer, Y.; Lemesre, V.; Bellanger, D.; Bieche, I.; Marangoni, E.; Sastre-Garau, X.; Mieulet, V.; Mechta-Grigoriou, F. MAP3K8/TPL-2/COT Is a Potential Predictive Marker for MEK Inhibitor Treatment in High-Grade Serous Ovarian Carcinomas. Nature Communications 2015, 6. https://doi.org/10.1038/ncomms9583.
• Costa, A.; Scholer-Dahirel, A.; Mechta-Grigoriou, F. The Role of Reactive Oxygen Species and Metabolism on Cancer Cells and Their Microenvironment. . Seminars in Cancer Biology 2014, 25, 23–32. https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2013.12.007.
• Batista, L.; Gruosso, T.; Mechta-Grigoriou, F. Ovarian Cancer Emerging Subtypes: Role of Oxidative Stress and Fibrosis in Tumour Development and Response to Treatment International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2013, 45 (6), 1092–1098.
• Scholer-Dahirel, A.; Costa, A.; Mechta-Grigoriou, F. Control of Cancer-Associated Fibroblast Function by Oxidative Stress: A New Piece in the Puzzle. Cell Cycle 2013, 12 (14), 2169. https://doi.org/10.4161/cc.25547.
• Mateescu, B.; Batista, L.; Cardon, M.; Gruosso, T.; de Feraudy, Y.; Mariani, O.; Nicolas, A.; Meyniel, J.-P.; Cottu, P.; Sastre-Garau, X.; Mechta-Grigoriou, F. MiR-141 and MiR-200a Act on Ovarian Tumorigenesis by Controlling Oxidative Stress Response. Nature Medicine 2011, 17 (12), 1627–1635. https://doi.org/10.1038/nm.2512.
• Toullec, A.; Gerald, D.; Despouy, G.; Bourachot, B.; Cardon, M.; Lefort, S.; Richardson, M.; Rigaill, G.; Parrini, M.-C.; Lucchesi, C.; Bellanger, D.; Stern, M.-H.; Dubois, T.; Sastre-Garau, X.; Delattre, O.; Vincent-Salomon, A.; Mechta-Grigoriou, F. Oxidative Stress Promotes Myofibroblast Differentiation and Tumour Spreading. EMBO Molecular Medicine 2010, 2 (6), 211–230. https://doi.org/10.1002/emmm.201000073.

L’hétérogénéité des cellules du microenvironnement d’une tumeur, tant stromale que tumorale, est un facteur majeur qu’il est nécessaire de prendre en compte dans le traitement des patients atteints de cancer, puisqu’il participe, au moins en partie, aux phénomènes de résistance et de rechute thérapeutique. En caractérisant à la fois l’hétérogénéité tumorale et stromale en interaction avec les cellules immunitaires, nous avons mis à jour des différences de réponse vis-à-vis des traitements actuellement utilisés en clinique.

Nos travaux montrent l’importance de considérer la tumeur dans son ensemble afin de comprendre comment sont médiées les réponses aux différents traitements utilisés en clinique.  Au laboratoire, nous souhaitons développer des nouvelles technologies permettant de se rapprocher de la physiopathologie et la physionomie des tumeurs. Les techniques de culture en 3D permettant l’incorporation de différents types cellulaires sont en plein essor et très prometteuses. En effet, ils permettent de reconstituer la complexité des tumeurs d’un point de vue structurel, biochimique et biophysique, et de questionner les relations existantes entre les différentes populations cellulaires en condition basale ou alors conséquent à un traitement. En collaboration avec l’équipe de Stéphanie Descroix, notre équipe de recherche développe un nouveau modèle de co-culture cellulaire en 3D : le Tumor-on-Chip (ToC). Cette approche, basée sur un dispositif de microfluidique, permet de reconstituer ex-vivo, la complexité de l’écosystème tumorale. Conjugué à un système de vidéo-microscopie, nous pouvons visualiser des dynamiques cellulaires en temps réel. Nous sommes ainsi en mesure d’étudier, de manière intégrée, les mécanismes cellulaires impliqués dans la réponse aux traitements et de caractériser l’ensemble des relations spatio-temporelles existant entre les cellules stromales, immunitaires et tumorales.

Représentation schématique du système de culture ex-vivo « Tumor-on-Chip » permettant la co-culture de plusieurs types cellulaires, en 3D.

Perspectives de recherche :

Par des approches de transcriptomique spatiale, nous avons pu définir un modèle d’organisation cellulaire au sein des tumeurs. Nous souhaitons désormais déterminer si la co-culture des différents types cellulaires (cellules tumorales, immunitaires et CAF) issu d’échantillons de patients au sein des ToC reproduit la configuration spatiale observée dans les tumeurs.

Publications de l’équipe associées :

• Veith, I., Camonis J., Descroix S., Shirvani H., Mechta-Grigoriou F., Zalcman G., Parrini MC., Martinelli E. Apoptosis mapping in space and time of 3D tumor ecosystems reveals transmissibility of cytotoxic cancer death. PLoS Comput Biol 2021, 17(3): e1008870 https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1008870
• Parrini MC. Models for Immuno-oncology research. Tumour-on-chip breakthrough. Cancer Cell. 2020, 10;38(2):145-147. https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.07.010.
• Gentric, G.; Kieffer, Y.; Mieulet, V.; Goundiam, O.; Bonneau, C.; Nemati, F.; Hurbain, I.; Raposo, G.; Popova, T.; Stern, M.-H.; Lallemand-Breitenbach, V.; Müller, S.; Cañeque, T.; Rodriguez, R.; Vincent-Salomon, A.; de Thé, H.; Rossignol, R.; Mechta-Grigoriou, F. PML-Regulated Mitochondrial Metabolism Enhances Chemosensitivity in Human Ovarian Cancers. Cell Metabolism 2019, 29 (1), 156-173.e10. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2018.09.002.
• Nguyen M, De Ninno A, Mencattini A, Mermet-Meillon F, Fornabaio G, Evans SS, Cossutta M, Khira Y, Han W, Sirven P, Pelon F, Di Giuseppe D, Bertani FR, Gerardino A, Yamada A, Descroix S, Soumelis V, Mechta-Grigoriou F, Zalcman G, Camonis J, Martinelli E, Businaro L, Parrini MC. Dissecting Effects of Anti-cancer Drugs and Cancer-Associated Fibroblasts by On-Chip Reconstitution of Immunocompetent Tumor Microenvironments. Cell Report 2018, 26;25(13):3884-3893.e3. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.12.015.