Dynamique de l'organisation intracellulaire

Mots clés : appareil de Golgi, CLIP-170, anticorps recombinants, microtubules, tubuline, sécrétion

Consultez le rapport d'activité scientifique. (pdf 300Ko, mise à jour 12 février 2009)

Notre travail s'oriente selon deux grands axes, avec chaque fois un important espace dévolu aux développements technologiques. D'une part, nous nous intéressons à la dynamique de l'appareil de Golgi, plateforme centrale de traitement et de tri des voies de trafic intracellulaire. D'autre part, nous étudions les mécanismes régulant la dynamique des microtubules, et plus particulièrement le rôle joué par des protéines de la famille de CLIP-170 dans ce contrôle. Pour ces études, nous avons développé des méthodes permettant d'obtenir des outils uniques, comme les anticorps recombinants, dont nous étendons maintenant les applications, notamment au domaine thérapeutique.

Nos approches sont fondées sur des méthodes d'imagerie des cellules vivantes, d'analyse quantitative du trafic intracellulaire et de la dynamique des microtubules et sur l'utilisation de perturbateurs de la fonction normale des protéines cellulaires (siRNA, mutants, molécules). Plus récemment, nous avons contribué à la mise en place d'une plateforme de criblage cellulaire à haut débit (BioPhenics, Département de Transfert).
Un investissement plus particulier a été fait ses dernières années pour adapter les méthodes de sélection d'anticorps recombinants aux questions de la biologie cellulaire (Nizak et al., 2005).

Fig. 1 

La banque d'anticorps recombinants que nous utilisons est une banque de scFv (single chain Fv fragments: fragments Fv dont les chaînes lourdes et légères sont réunies dans la même molécule), comportant plus de 10⁹ clones différents, elle a été obtenue auprès du laboratoire de Greg Winter (MRC, Cambridge, GB).

1 - Les anticorps recombinants

Notre équipe a développé de nouvelles méthodes de sélection d'anticorps permettant de préparer les antigènes cibles sans passer par l'expression et la purification chez E. coli. Nous avons aussi mis au point des procédés permettant de sélectionner des anticorps dirigés contre certaines conformations des protéines cibles ou contre des modifications post-traductionnelles. Nous avons également simplifié et amélioré la production d'anticorps recombinants.
Ces méthodes mises au point par notre équipe sont utilisées dans des programmes de recherche en biologie cellulaire et pour des projets appliqués au traitement de certains cancers. En collaboration avec l'équipe “Cellules dendritiques et présentation antigénique” nous tentons notamment d'améliorer l'efficacité d'un anticorps ciblant la surface de nombreuses cellules cancéreuses.

Notre équipe s'intéresse également aux anticorps sensibles aux changements conformationnels ou aux modifications post-traductionnelles. Ces anticorps peuvent être utilisés comme anticorps intra-cellulaires (intrabodies) pour suivre la dynamique des protéines endogènes (Nizak et al., 2003a,b). Nous avons par exemple sélectionné un anticorps sensible aux changements conformationnels de la tubuline (voir plus loin) et des anticorps spécifiquement dirigés contre les formes liées au GTP de la petite GTPase Rab6 (Figure 2, Nizak et al., 2003).

Fig. 2 

2 - Structure, dynamique et fonction de l'appareil de Golgi

Notre équipe étudie le rôle de l'appareil de Golgi dans l'organisation cellulaire (Chabin-Brion et al., 2001) et les fonctions de certaines protéines localisées en périphérie. Ces protéines font partie de la matrice golgienne et sont organisées autour du complexe formé par les protéines Giantine/GM130/p115. Nous avons étudié la Giantine (Nizak et al., 2003b), et les protéines Rab1 et Rab6. (Del Nery, 2006 ; Sannerud, 2006 ; Miserey-Lenkei, 2006). Plus récemment, en collaboration avec Y. Wang (University of Michigan, USA), nous avons entrepris l'étude de GRASP-65, une autre protéine de la matrice golgienne, plus particulièrement mise en jeu dans la structuration de l'appareil de Golgi et dans sa dynamique mitotique. Pour étudier la maintenance de l'appareil de Golgi, nous avons étudié son mode d'héritage pendant la division cellulaire (Nizak et al., 2004), Par ailleurs, nous avons développé une méthode permettant d'inactiver l'appareil de Golgi dans des cellules vivantes. Cela nous a permis de proposer que l'appareil de Golgi se forme à partir d'éléments appartenant au réticulum endoplasmique mais que sa maturation finale, fonctionnelle et structurale, nécessite des composant transportés de façon rétrograde depuis les membranes golgiennes déjà formées (Jollivet et al., 2007). Nous avons maintenant entrepris de mettre en place un système générique permettant d'étudier finement l'activité de l'appareil de Golgi.

Fig. 3 

3 - CLIP170, CLIPR et Dynamique des microtubules

 Les microtubules sont des éléments polarisés et dynamiques du cytosquelette dont l'extrémité moins, à polymérisation lente, est en général orientée vers le centre de la cellule, et dont l'extrémité plus est dirigée vers la périphérie de la cellule. Les microtubules sont dynamiquement instables, alternant de façon apparemment stochastique entre des phases de polymérisation et de dépolymérisation séparées par des événements de catastrophe et de sauvetage.

Nous étudions la régulation de la dynamique des microtubules (Marceiller et al ., 2005, coll. Équipe de Christian Poüs, Chatenay-Malabry) et certaines protéines de type CLIP (cytoplasmic linker proteins) mises en jeu dans la régulation de l'instabilité dynamique. Nous avions montré il y a quelques années (Perez et al., 1999, Diamantopoulos, 1999) que la protéine CLIP-170 se localise à l'extrémité plus de microtubules en phase de croissance (Figure 4), fondant ainsi la classe de protéines nommées +TIPs (+ end tracking proteins). Nous travaillons également à l'analyse fonctionnelle de CLIPR-59, une protéine apparentée à CLIP-170 et qui régule de façon négative la dynamique des microtubules (Perez et al, 2002, Lallemand-Breitenbach et al., 2004).

Fig. 4 

Plus récemment, nous avons sélectionné un anticorps sensible aux changements de conformation de la tubuline et nous avons ainsi pu vérifier la présence d'une coiffe de GTP à l'extrémité des microtubules en phase de polymérisation ainsi que la présence inattendue d'îlots de GTP dans le polymère. Ceci nous a conduit à proposer un nouveau modèle d'instabilité dynamique des microtubules.

Fig. 5 

Dernière mise à jour : février 2009

Publications clés

2008

• Dimitrov A, Quesnoit M, Moutel S, Cantaloube I, Pous C, Perez F
  Detection of GTP-Tubulin Conformation in Vivo Reveals a Role for GTP Remnants in Microtubule Rescues
  Science, 322:1353-6

2007

• Jollivet, F. Raposo, G. Dimitrov, A. Sougrat, R. Goud, B. Perez, F.
  Analysis of De Novo Golgi Complex Formation after Enzyme-based Inactivation
  Mol Biol Cell, 18:4637-4647 - Abstract
  The Golgi complex is characterized by its unique morphology of closely apposed flattened cisternae that persists despite the large quantity of lipids and proteins that transit bidirectionally. Whether such a structure is maintained through endoplasmic reticulum (ER)-based recycling and auto-organization or whether it depends on a permanent Golgi structure is strongly debated. To further study Golgi maintenance in interphase cells, we developed a method allowing for a drug-free inactivation of Golgi dynamics and function in living cells. After Golgi inactivation, a new Golgi-like structure, containing only certain Golgi markers and newly synthesized cargos, was produced. However, this structure did not acquire a normal Golgi architecture and was unable to ensure a normal trafficking activity. This suggests an integrative model for Golgi maintenance in interphase where the ER is able to autonomously produce Golgi-like structures that need pre-existing Golgi complexes to be organized as morphologically normal and active Golgi elements.
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2003

• Nizak C., Monier S., Del Nery E., Moutel S., Goud B., Perez F.
  Recombinant Antibodies to the Small GTPase Rab6 as Conformation Sensors
  Science, 300:984-987 - Abstract
  Here we report an approach, based on antibody phage display, to generate molecular conformation sensors. Recombinant antibodies specific to the guanosine triphosphate (GTP)-bound conformation of the small guanosine triphosphatase (GTPase) Rab6, a regulator of membrane traffic, were generated and used to locate Rab6.GTP in fixed cells, and, after green fluorescent protein (GFP) tagging and intracellular expression, to follow Rab6.GTP in vivo. Rab6 was in its GTP-bound conformation on the Golgi apparatus and transport intermediates, and the geometry of transport intermediates was modulated by Rab6 activity. More generally, the same approach could be applied to other molecules that can be locked in a particular conformation in vitro.
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2002

• Perez F., Pernet-Gallay K., Nizak C., Goodson H. V., Kreis T. E., Goud B.
  CLIPR-59, a new trans-Golgi/TGN cytoplasmic linker protein belonging to the CLIP-170 family
  J. Cell Biol., 156:631-642 - Abstract
  The microtubule cytoskeleton plays a fundamental role in cell organization and membrane traffic in higher eukaryotes. It is well established that molecular motors are involved in membrane-microtubule interactions, but it has also been proposed that nonmotor microtubule-binding (MTB) proteins known as CLIPs (cytoplasmic linker proteins) have basic roles in these processes. We report here the characterization of CLIPR-59, a CLIP-170-related protein localized to the trans-most part of the Golgi apparatus. CLIPR-59 contains an acidic region followed by three ankyrin-like repeats and two CLIP-170-related MTB motifs. We show that the 60-amino acid-long carboxy-terminal domain of CLIPR-59 is necessary and sufficient to achieve Golgi targeting, which represents the first identification of a membrane targeting domain in a CLIP-170-related protein. The MTB domain of CLIPR-59 is functional because it localizes to microtubules when expressed as a fragment in HeLa cells. However, our results suggest that this domain is normally inhibited by the presence of adjacent domains, because neither full-length CLIPR-59 nor a CLIPR-59 mutant missing its membrane-targeting region localize to microtubules. Consistent with this observation, overexpression of CLIPR-59 does not affect the microtubule network. However, CLIPR-59 overexpression strongly perturbs early/recycling endosome-TGN dynamics, implicating CLIPR-59 in the regulation of this pathway.
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1999

• Perez F., Diamantopoulos G. S., Stalder R., Kreis T. E.
  CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo
  Cell, 96:517-27 - Abstract
  A chimera with the green fluorescent protein (GFP) has been constructed to visualize the dynamic properties of the endosome-microtubule linker protein CLIP170 (GFP-CLIP170). GFP-CLIP170 binds in stretches along a subset of microtubule ends. These fluorescent stretches appear to move with the growing tips of microtubules at 0.15-0.4 microm/s, comparable to microtubule elongation in vivo. Analysis of speckles along dynamic GFP-CLIP170 stretches suggests that CLIP170 treadmills on growing microtubule ends, rather than being continuously transported toward these ends. Drugs affecting microtubule dynamics rapidly inhibit movement of GFP-CLIP170 dashes. We propose that GFP-CLIP170 highlights growing microtubule ends by specifically recognizing the structure of a segment of newly polymerized tubulin.
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